体外用gtpγs/gdp处理蛋白以用作阳性和阴性的对照
注意:在细胞体内环境条件下大约有10%的cdc42被激l活,而在体外用gtpγs处理大约有90%的cdc42被激l活。
1. 准备两个离心管,g蛋白活性检测试剂盒,每个管中各加入0.5 ml的细胞提取物(如果是纯的cdc42蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug)。
2. 每个管中加入20ul 0.5m edta(终浓度即为20 mm)。
3. 一个管中加入5ul的100x gtpγs(终浓度即为100 um)作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100x gdp(终浓度即为1 mm)作为阴性对照。
4. 将离心管置于30°c条件下反应30min并不断搅动。
5. 终止反应:将管置于冰上并加入32.5ul 1m mgcl2(终浓度即为60mm)。
arf样蛋白1(arl1)是gtpases的ras超家族中的调控性gtpases arf家族的成员,并且在整个真核生物中都具有高度保守的直系同源基因。 arl1对果蝇和秀丽隐杆线虫的早期胚胎发育---。 arl1在主要序列,细胞定位和功能(膜运输调节)上与arf1-6较相似,甚至共享几个共同的结合伴侣。 除了其在高尔基体/反式高尔基体网络中的膜运输功能中,还有---表明arl1在酵母中的离子稳态中可能发挥作用。
arf6激l活测定。 经gdp(lane1)或gtpγs(lane 2)处理后,纯化的arf6蛋白被免l疫沉淀。 用抗活性arf6单克l隆抗l体进行免l疫沉淀。
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neweast biosciences arf6激l活检测试剂盒基于特定于配置的单克l隆抗l体和arf6特---兔多克l隆抗l体,该抗l体特---识别arf6-gtp,但不能识别arf6-gdp。 鉴于单克l隆抗l体对其抗原的高度亲和力,可以在短时间内进行激l活测定。 该测定法可提供---的结果,并具有一致的可重复性。
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