ip-wb活性检测试剂盒-武汉纽斯特

武汉纽斯特生物科技有限公司（wuhanneweastbiotechonologyco.ltd），系美国生命科学试剂供应商美国neweastbio在的子公司。美国neweastbio---于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、elisa试剂盒、蛋白等。

悬浮细胞

1.培养细胞并根据需要用活化剂或抑制l剂---。

2.进行细胞计数，然后通过离心沉淀细胞。

3.吸出培养基，并用冰冷的pbs洗涤两次。

4.完全除去pbs洗涤液，然后向细胞沉淀中加入冰冷的1x分析/裂解缓冲液

   （每1 x 107池0.5 – 1 ml）。

5.通过重复移液裂解细胞。

6.将裂解物转移至适当大小的试管中，并置于冰上。

7.如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。如果这

   发生时，裂解液可通过27?号注射l器针头3-4次以剪切

   基因组dna。

8.通过离心10分钟（在4°c下为12，000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-

   70°c以备将来使用。

阳性和阴性对照的体外gtpγs/ gdp蛋白质上样量

    注意：体内---细胞会激l活大约10％的可用rab35，而

    体外gtpγs蛋白负载将激l活近90％的rab35。

1.将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的rab35蛋白）。

2.向每个试管中加入20 μl 0.5 m edta（至20 mm终浓度）。

3.将5 μl 100 xgtpγs（至100 μm，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。

4.在第二个试管中加入5 μl 100 x gdp（至1 mm，终浓度）（阴性对照）。

5.在搅拌下将试管在30°c孵育30分钟。

6.通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2（至60 mm）。